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featureCounts

FeatureCounts 是 Subread 软件包中的一个模块，专门用于从比对文件（如 BAM 或 SAM）中快速计数基因或外显子的读段数量。它以其速度快、内存消耗低、功能全面而受到广泛使用。FeatureCounts 适用于各种测序数据（如 RNA-Seq、ChIP-Seq 等），支持基因水平和转录本水平的计数，可以对多种特征（如外显子、基因、CDS）进行高效的计数分析。

安装 featureCounts

使用 Bioconda 安装

mamba install -c bioconda subread

基本使用

featureCounts 的基本使用如下

# 输入
annotation=~/test/data/ref/genome.gtf   # 指定基因注释文件（GTF 或 GFF 格式）
bam=~/test/1_mapping/hisat2/sample.bam  # bam 或 sam比对文件。 支持同时输入多个比对文件

featureCounts \
    -T 2 -t exon \      
    -g gene_id -p \
    -a ${annotation} \
    -o gene_counts.txt ${bam}
  • -T <int>：指定使用的线程数（默认为 1）

参数解析

1. 必需参数

  • -a <string>：指定注释文件（如 GTF/GFF 格式）。支持 .gz 压缩格式。也可使用 annotation 目录中的内置 SAF 格式注释文件。
  • -o <string>：指定输出文件名称。将保存读段计数结果及总结统计信息（文件名为 <string>.summary）。
  • input_file1 [input_file2] ...：输入比对文件列表（SAM 或 BAM 格式）。可接受按名称或位置排序的文件。如果未提供，则从标准输入读取数据。

2. 注释文件相关参数

  • -F <string>：指定注释文件格式（GTF 或 SAF），默认 GTF。
  • -t <string>：指定 GTF 文件中的特征类型（默认为 exon），支持多类型，以 , 分隔。
  • -g <string>：指定 GTF 文件中的基因属性字段（默认为 gene_id）。
  • --extraAttributes：从 GTF 文件中提取额外的属性类型，并将其包含在计数结果中。多个属性类型用 , 分隔。
  • -A <string>：指定染色体名称别名文件（两列：注释文件中的染色体名，读段文件中的染色体名）。

3. 计数级别和总结参数

  • -f：在特征级别进行计数（例如，计算外显子的读段，而不是基因）。
  • -O：将读段分配给所有重叠的特征。
  • --minOverlap <int>：指定读段与特征的最小重叠碱基数（默认为 1）。
  • --fracOverlap <float>：指定读段与特征的最小重叠比例（范围 [0,1]，默认为 0）。
  • --fracOverlapFeature <float>：指定特征中与读段的最小重叠比例（范围 [0,1]，默认为 0）。
  • --largestOverlap：将读段分配给重叠最大区域的特征。
  • --nonOverlap <int>：读段中允许的最大非重叠碱基数（默认为不限制）。
  • --nonOverlapFeature <int>：特征中允许的最大非重叠碱基数（默认为不限制）。

4. 多重比对相关参数

  • -M：计数多重比对的读段。所有比对位置将被计数（依赖 NH 标签）。
  • --fraction：对特征分配分数计数。需与 -M 或 -O 参数一起使用。

5. 读段过滤参数

  • -Q <int>：指定最低比对质量分数（默认为 0），低于该质量的读段将被忽略。
  • --splitOnly：仅计算分割比对（N 操作符出现在 CIGAR 中）。
  • --nonSplitOnly：仅计算非分割比对（CIGAR 中不包含 N）。
  • --primary：仅计算主比对的读段（使用 0x100 标志位）。
  • --ignoreDup：忽略重复读段（根据 0x400 标志位识别）。

6. 链特异性相关参数

  • -s <int or string>

：执行链特异性计数。

  • 0：不考虑链特异性。
  • 1：考虑正向链特异性。
  • 2：考虑反向链特异性。

7. 双端测序相关参数

  • -p：指定为双端测序数据。
  • --countReadPairs：计算片段数（而非读段数），仅适用于双端测序数据。
  • -B：仅计数两端均成功比对的读段对。
  • -P：检查双端读段对的比对距离是否符合要求（使用 -d 和 -D 设置阈值）。
  • -d <int>：设置最小片段长度（默认为 50）。
  • -D <int>：设置最大片段长度（默认为 600）。
  • -C：不计数两端比对到不同染色体或同染色体但不同链的读段对。
  • --donotsort：不对输入 BAM/SAM 文件进行排序，要求同一读段对的两端必须在文件中相邻。

8. 长读段相关参数

  • -L：计算长读段（如 Nanopore 和 PacBio 数据）。仅适用于单线程模式，且只能计算读段（不计算读段对）。

9. 输出详细分配结果

  • -R <format>：输出每个读段的详细分配结果（格式：CORE、SAM 或 BAM）。
  • --Rpath <string>：指定保存详细分配结果的目录。若未指定，则使用计数结果保存的目录。

10. 杂项参数

  • --tmpDir <string>：指定保存中间文件的目录（默认与 -o 参数指定的目录一致）。
  • --maxMOp <int>：CIGAR 字符串中允许的最大 M 操作符数量（默认为 10）。
  • --verbose：输出详细的调试信息（如未匹配的染色体/contig 名称）。
  • -v：输出程序版本信息。