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bcftools

bcftools mpileup

bcftools mpileup 用于通过堆叠比对数据生成变异候选位点的序列深度信息。从 BAM 文件生成 pileup 信息，并输出用于变异检测的 VCF 格式文件。通常与 bcftools call 配合使用以进行变异检测。

# 输入
fa=genome.fa
bam=sample.bam

bcftools mpileup \
    -f $fa
    -O z -0 sample_mpileup.vcf.gz $bam

Tip

bcftools mpileup 生成的 VCF 文件和常规 VCF 文件有一些关键区别。主要包含每个位点的碱基堆叠深度、质量等信息，并未进行真正的变异调用和过滤。因此它可能包含更多的低置信度变异位点。并不是最终的已筛选和注释的变异信息。

mpileup 参数解析

Usage: bcftools mpileup [options] in1.bam [in2.bam [...]]
  • -6, --illumina1.3+：质量分数符合 Illumina-1.3+ 格式。
  • -A, --count-orphans：包括非正常配对的读段（如 PAIRED 标志设置，但 PROPER_PAIR 标志未设置）。
  • -b, --bam-list FILE：指定 BAM 文件的列表，文件中每行一个 BAM 文件名。
  • -B, --no-BAQ：禁用 BAQ（基于对齐的质量评分）。
  • -C, --adjust-MQ INT：调整映射质量评分，以减少假阳性（默认 0）。
  • -D, --full-BAQ：在所有位置应用 BAQ，不仅仅是问题区域。
  • -d, --max-depth INT：每个文件的最大深度，防止过多内存使用（默认 250）。
  • -E, --redo-BAQ：在计算时重新生成 BAQ，忽略现有的 BAQ。
  • -f, --fasta-ref FILE：指定 Faidx 索引的参考序列文件，必选参数。
  • -q, --min-MQ INT：跳过映射质量低于此值的读段（默认 0）。
  • -Q, --min-BQ INT：跳过碱基质量低于此值的碱基（默认 1）。
  • -a, --annotate LIST：指定要输出的可选标记，“\？”，以查看所有可用标记。
  • -o, --output FILE：指定输出文件名，默认输出到标准输出。
  • -O, --output-type TYPE：设置输出格式'b'：压缩的 BCF 格式，'u'：未压缩的 BCF 格式，'z'：压缩的 VCF 格式，'v'：未压缩的 VCF 格式，0-9：指定压缩级别，用于控制文件大小和处理速度。
  • --threads INT：指定用线程数。
  • -W, --write-index[=FMT]：自动生成输出文件的索引，参数FMT为索引格式【例如 csi 或 tbi】。
  • -X, --config STR：选择指定平台配置文件【-X list 列出所有配置】。
  • -e, --ext-prob INT：Phred 值表示的 gap 扩展的序列错误概率（默认 20）。
  • -I, --skip-indels：不调用 INDEL 变异。
  • -L, --max-idepth INT：每个文件 INDEL 变异调用的最大深度（默认 250）。
  • -m, --min-ireads INT：INDEL 候选位置最小插入读段数（默认 2）。

bcftools call

bcftools call 是一个用于对变异位点进行调用的工具，可用于生成单倍型和变异文件（VCF/BCF 格式）。常和 bcftools mpileup 配合使用。

# 使用 bcftools call 对 mpileup 文件进行变异调用：

bcftools call -mv -Oz -o P1_raw.vcf.gz P1_mpileup.vcf.gz

Warning

未指定样本文件和倍性时，默认分析所有样本并假设样本为二倍体。--ploidy 用于设置样本的倍性，比如二倍体（diploid）或多倍体（polyploid）。

  • -m：启用多态性调用模式，以处理可能的多等位基因变异。

  • -v：只输出变异位点，避免非变异位点输出。

  • -Oz：指定输出格式为压缩的 VCF（gzip）。

  • -o calls.vcf.gz：指定输出文件名。

一般分析中可以合并两步

# 输入
fa=genome.fa
bam=sample.bam

bcftools mpileup -f $fa $bam ｜bcftools call -mv -Oz -o P1_raw.vcf.gz

bcftools filter

用于在 VCF 文件中根据用户定义的阈值条件对变异位点进行筛选和标记。

bcftools filter [options] <in.vcf.gz>

# 一般过滤参数
bcftools filter \
    --include 'INFO/DP>20 && QUAL>30' \
    --SnpGap 5 --IndelGap 10 \
    -o P1_filter3.vcf -O v all_raw.vcf

主要过滤参数

-e, --exclude EXPR：排除符合给定条件（EXPR）的变异位点。仅在表达式为真时排除位点。例如，要排除质量小于20的变异位点：