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LoFreq

LoFreq 是一个用于从高通量测序数据（如 Illumina 数据）中精确检测低频率变异的软件。它通过建模测序错误来提高对低频率突变的检测能力。LoFreq 能够分析对齐后的 BAM 文件，适用于研究病毒、癌症等需要高灵敏度变异检测的领域。

主要功能

  1. lofreq viterbi：测序错误校正：通过整合局部贝叶斯模型来校正测序错误，以提高变异检测的准确性。

  2. lofreq indelqual：插入质量分数：将 Indel 质量分数插入已经比对好的 BAM 文件中，进一步增强后续变异检测的准确性。

  3. lofreq call：突变调用：LoFreq 能检测出极低频率的变异，如点突变（SNP）和小的插入缺失（indel）。

  4. lofreq filter：突变过滤：过滤低置信度或可疑的突变。

使用

比对校正

LoFreq Viterbi 模块用于对已经比对好的 BAM 文件进行局部的比对校正。这个模块会重新比对读段，修正因初次比对不准确而导致的假阳性突变检测，特别是在具有高错误率的区域。

lofreq viterbi \
    -f reference.fasta \
    -o realigned.bam input.bam

参数:

  • -f | --ref FILE：指定参考基因组的 FASTA 文件（必须是已建立faidx索引）。
  • -k | --keepflags：默认情况下，LoFreq Viterbi 会删除一些容易在重新比对中发生变化的标志（MC、MD、NM 和 A）。使用此选项可以保持这些标志不被删除。
  • -o | --out：指定输出的BAM 文件，默认 stdout 。

插入缺失质量

在调用 indel 之前，LoFreq 提供了一个专门用于插入缺失质量校正的模块。测序数据中的 indel 质量评分可能存在偏差，因此可以使用该模块进行质量校正，以确保 indel 调用的准确性。

lofreq indelqual \
    --dindel \
    -f reference.fasta \
    -o output_with_indelquals.bam input.bam

参数：

  • --dindel：指定使用 Dindel 方法来计算 Indel 质量分数，如果不使用 --dindel，默认使用 "uniform" 方法插入固定的 Indel 质量分数。

  • -f | --ref：参考基因组的 FASTA 文件（Only required for --dindel）。

  • -o | --out：输出 BAM 文件。默认值为标准输出（stdout）。

Note

LoFreq 的 Indel Quality 模块适用于那些未经过 GATK BQSR 校正的 Illumina 测序数据，通过使用 uniform 或 dindel 模式，用户可以为 indel 提供合适的质量分数，从而提高变异检测的准确性。

突变调用

LoFreq 的核心模块，用于从排序好的 BAM 文件中检测单核苷酸变异（SNP）和小的插入缺失（Indels）。这个模块可以精确检测样本中低频的变异。

lofreq call \
    -f ~/reference/genome.fa \
    -o sample.vcf sorted_input.bam

Warning

输出的VCF 文件中，缺少具体的基因型信息。LoFreq 专注于高精度变异检测，特别是低频变异。低频变异常见于病毒群体或肿瘤细胞中，由于其频率较低，直接输出基因型可能不如等位基因频率（AF）精确。因此，LoFreq 更加侧重于等位基因频率、覆盖深度和变异位点的置信度，而不是直接输出基因型（如 GATK 中的 0/1 或 1/1）。

变异过滤

LoFreq Filter 模块用于过滤突变调用结果。突变调用的结果可能包含低覆盖度或质量不达标的变异，这些低置信度的变异可以通过该模块进行过滤。

基本用法

lofreq filter [options] -i input.vcf -o output.vcf

参数解析

1. 文件处理参数

  • -i | --in FILE: 输入的 VCF 文件，支持 gzip 压缩的 VCF 文件。
  • -o | --out FILE: 输出的 VCF 文件，默认值为 stdout（标准输出），也支持 gzip 压缩的输出。

2. 覆盖度过滤（Coverage - DP）

  • -v | --cov-min INT: 设置最小覆盖度，低于此值的变异将被过滤。默认关闭（小于1则关闭）。
  • -V | --cov-max INT: 设置最大覆盖度，高于此值的变异将被过滤。默认关闭（小于1则关闭）。

3. 等位基因频率过滤（Allele Frequency - AF）

  • -a | --af-min FLOAT: 设定最小等位基因频率，低于此频率的变异将被过滤。负值则关闭此过滤条件。
  • -A | --af-max FLOAT: 设定最大等位基因频率，高于此频率的变异将被过滤。负值则关闭此过滤条件。

4. 链偏性过滤（Strand Bias - SB）

LoFreq 支持对链偏性进行过滤，主要用于过滤具有显著链偏性的变异。当突变的 p 值小于设定的阈值并且 85% 的突变碱基来自同一链时，将被视为有链偏性。

  • -B | --sb-thresh INT: 设置链偏性过滤的最大 phred 值（质量值）。与 -b 冲突。
  • -b | --sb-mtc STRING: 选择多重检验校正方法，bonf（Bonferroni），holm 或 fdr（假发现率）。与 -B 冲突。
  • -c | --sb-alpha FLOAT: 设置多重检验校正的 p 值阈值。
  • --sb-no-compound: 关闭组合过滤条件，即不需要 85% 的突变碱基来自同一链。
  • --sb-incl-indels: 将链偏性过滤应用于 indel（插入缺失）突变。

5. SNV 质量过滤（SNV Quality）

对单核苷酸变异（SNV）的过滤可以通过质量评分和多重检验校正来实现。

  • -Q | --snvqual-thresh INT: 设置最低质量的 phred 值，低于此值的 SNV 将被过滤。与 -q 冲突。
  • -q | --snvqual-mtc STRING: 选择多重检验校正方法，bonf（Bonferroni），holm 或 fdr。与 -Q 冲突。
  • -r | --snvqual-alpha FLOAT: 设置多重检验校正的 p 值阈值。
  • -s | --snvqual-ntests INT: 设定 SNV 的多重检验测试次数。

6. Indel 质量过滤

与 SNV 类似，indel 质量也可以基于 phred 值和多重检验校正进行过滤。

  • -K | --indelqual-thresh INT: 设置 indel 的最低质量 phred 值。与 -k 冲突。
  • -k | --indelqual-mtc STRING: 选择多重检验校正方法，bonf、holm 或 fdr。与 -K 冲突。
  • -l | --indelqual-alpha FLOAT: 设置多重检验校正的 p 值阈值。
  • -m | --indelqual-ntests INT: 设置 indel 的多重检验测试次数。

7. 其他选项（Misc. Options）

  • --only-indels: 仅保留 indels。
  • --only-snvs: 仅保留 SNVs。
  • --print-all: 打印所有变异，而不仅仅是通过过滤的变异。
  • --no-defaults: 移除所有默认的过滤设置，完全自定义过滤条件。
  • --verbose: 输出详细的处理信息。
  • --debug: 启用调试模式，打印更详细的调试信息。

默认过滤设置

如果不使用 --no-defaults，LoFreq 会自动应用一些预定义的过滤条件。可以使用 --verbose 查看具体的默认过滤器设置。如果你想完全自定义过滤规则，建议添加 --no-defaults 参数以禁用默认的过滤器。

典型使用示例

  1. 过滤覆盖度不足的变异: 

    lofreq filter -i input.vcf -o output.vcf --cov-min 10

  2. 应用链偏性过滤: 

    lofreq filter -i input.vcf -o output.vcf --sb-thresh 20 --sb-alpha 0.01

  3. 应用多重检验校正的 SNV 质量过滤: 

    lofreq filter -i input.vcf -o output.vcf --snvqual-mtc fdr --snvqual-alpha 0.05

  4. 仅保留 indel: 

    lofreq filter -i input.vcf -o output.vcf --only-indels