Cufflinks

Cufflinks 是 RNA-Seq 数据分析的经典工具之一，用于从比对后的 BAM/SAM 文件中进行 转录本组装 和 基因表达定量。Cufflinks 可以组装新的转录本，也可以通过 GTF 注释文件指导转录本的组装和定量，输出的结果通常用于后续的差异表达分析或基因表达量的研究。Cufflinks 还支持生成 FPKM 值。

基本使用

表达定量

使用 Cufflinks 对 BAM 文件进行转录本组装和表达定量。

# 输入
gtf=genome.gtf
bam=sample.bam


cufflinks \
    -p 8 -G annotation.gtf \
    -o output_dir $bam

• -p 使用的核心数

• -G 根据参考转录本注释进行组装和定量分析

• -o 指定结果输出目录，默认为./

Warning

在使用 -G 指定GTF 文件时，Cufflinks 实际上并不是重新组装转录本，而是根据 GTF 文件的注释直接读取转录本信息并进行定量分析

输出文件

Cufflinks 运行后，会生成一系列输出文件，其中主要包括

transcripts.gtf：转录本组装结果文件（GTF 格式），包含组装的所有转录本。

isoforms.fpkm_tracking：转录本（isoform）的 FPKM 表达量估计。

genes.fpkm_tracking：基因的 FPKM 表达量估计。

skipped.gtf：未能成功组装的转录本信息。

参数解析

基本选项：

• -o/--output-dir：指定输出文件的目录，默认是当前目录 (./)。

• -p/--num-threads：设置使用的线程数量，默认是 1。

• --seed：随机数生成器的种子，默认是 0。

• -G/--GTF：根据参考转录本注释进行定量分析。

• -g/--GTF-guide：使用参考转录本注释引导组装。

• -M/--mask-file：忽略此文件中的转录本区域。

• -b/--frag-bias-correct：使用片段偏差校正，需提供参考 fasta 文件。

• -u/--multi-read-correct：使用多重比对拯救方法（提高准确性），默认 FALSE。

• --library-type：指定输入数据的文库类型（见下方支持的文库类型）。

  • ff-firststrand：前向-前向配对，第一链特异性文库。

  • ff-secondstrand：前向-前向配对，第二链特异性文库。

  • ff-unstranded：前向-前向配对，非链特异性文库。

  • fr-firststrand：前向-反向配对，第一链特异性文库。

  • fr-secondstrand：前向-反向配对，第二链特异性文库。

  • fr-unstranded：前向-反向配对，非链特异性文库（默认）。

丰度估算高级选项：

• -m/--frag-len-mean：设定片段长度均值（非配对读长），默认 200。
• -s/--frag-len-std-dev：设定片段长度标准差，默认 80。
• --max-mle-iterations：最大MLE计算的迭代次数，默认 5000。
• --compatible-hits-norm：仅使用与参考RNA兼容的比对进行归一化，默认 FALSE。
• --total-hits-norm：使用所有比对进行归一化，默认 TRUE。

组装高级选项：

• -L/--label：为组装的转录本设置ID前缀，默认 CUFF。
• -F/--min-isoform-fraction：抑制低于此丰度水平的转录本，默认 0.10。
• -I/--max-intron-length：忽略长度超过该值的内含子，默认 300000。
• --max-bundle-length：设定基因组包的最大长度，默认 3500000。
• --max-bundle-frags：设定每个基因组包中最大片段数，默认 500000。

参考注释引导组装选项：

• --no-faux-reads：禁用假设reads进行组装，默认 FALSE。
• --3-overhang-tolerance：合并到参考转录本时，允许的3'端overhang大小，默认 600。

程序行为选项：

• -v/--verbose：启用详细日志，默认 FALSE。
• -q/--quiet：启用安静模式，禁用进度条输出，默认 FALSE。
• --no-update-check：禁用自动更新检查，默认 FALSE。